在發(fā)明蛋白質印跡法（Western Blot）出現(xiàn)了30多年之后，這項技術仍然是獲取特定蛋白可靠鑒定的關鍵。許多近期涌現(xiàn)的產(chǎn)品利用各種方法來提高蛋白質印跡實驗的可重復性、敏感性、定量性以及速度。

有三個人都被認為發(fā)展了蛋白質的免疫印跡方法，但其中只有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白質印跡法）”的命名者，他就是當時在西雅圖哈欽森癌癥研究中心Bob Nowinski實驗室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年發(fā)明的一項技術，使用膠、尼龍膜和吸水紙去鑒定一個復雜個體中特定的DNA序列）、Northern Blotting（隨后發(fā)明出的相似策略，用于鑒定RNA）以及位于西海岸（West Coast）的Nowinski實驗室三者之意。

Burnette的技術成果直到1981年才得以發(fā)表。他回想起來，當時審稿人“特別”反對使用“Western blotting”這一名稱。但盡管如此，這個名稱還是沿襲了下來，而且蛋白質印跡技術也成為了zui廣泛使用的免疫化學技術之一。

工作原理

蛋白質印跡法的*步涉及到用凝膠電泳（Gelelectrophoresis）按照大小分離蛋白質，然后通過將膜置于膠上，將蛋白質轉移到膜上（通常是硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜），并在膜上加上若干片吸水紙，然后將這套堆層放在緩沖溶液中，這樣就能通過毛細管作用將蛋白質向上拉拽到膜上。這也就是所謂的濕法或槽式轉印法。

另外兩項技術是干法和半干轉印法，這兩種方法比傳統(tǒng)的濕轉印法更快也更規(guī)整，但是對于高分子量蛋白質而言，效率更低。對于半干轉印方法來說，膜和膠放置在被緩沖液浸泡過的濾紙層之間，將這些都夾在陰極和陽極之間，電流就能驅動蛋白質轉移到膜上。三種方法中，干法轉印zui快，但轉印效率也zui低。

轉印結束后，膜被放在稀釋過的蛋白質溶液中用來封閉非特異性的蛋白質結合。然后將膜與一抗進行孵育、洗脫，再與標記了信號檢測探針的二抗進行孵育。

zui后一步是檢測，通常采用化學發(fā)光或者熒光方法。在化學發(fā)光檢測中，與酶交聯(lián)的二抗能夠與檢測抗原產(chǎn)生光發(fā)生反應，可以被膠片或成像裝置捕獲。而在熒光檢測中，抗體探針被熒光集團所標記。

熒光檢測方法的主要優(yōu)勢在于，它可以同時檢測多個蛋白質，并且其信號更加一致。因此與化學發(fā)光檢測相比，也更有利于量化研究。

不少制造蛋白質印跡相關設備、軟件和消耗品的公司正在努力推動其中一些或所有步驟的自動化，期望能夠將這一實驗變得更加簡單有效。同時在實驗中加入了一些驗證點，讓研究人員能夠隨時監(jiān)測實驗進展，甚至重新打造整個過程?？茖W家們尋求的是性、穩(wěn)健性和策略化，從而能夠幫助他們避免浪費寶貴的造價高昂的抗體。

加速免疫檢測過程

轉印、抗體孵育、上樣和洗脫步驟占據(jù)了蛋白質印跡法實驗80%的時間，EMD Millipore公司“蛋白質印跡法解決方案”產(chǎn)品Michele Hatler這樣介紹。

這家總部位于加州泰梅庫拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白質檢測系統(tǒng)加速了整個過程，使用真空裝置通過膜推入試劑，而不僅僅依賴于擴散作用。這樣就能將免疫檢測的時間從4小時縮短到30分鐘，Hatler表示。她解釋說：“我們真正致力于提高蛋白質印跡工作流程的效率。我們仍然是按照傳統(tǒng)的步驟走，只是加了一個真空裝置。”

Hatler指出，2.0版本是于2012年9月推出的，相比之前的版本有幾個方面的優(yōu)勢。它可以使用中等大小的凝膠（8.5×13.5厘米）和迷你凝膠（7.5×8.4厘米），之前則只能用迷你凝膠。

“這一設備很便宜，操作也很簡便，但切實提高了實驗效率，節(jié)省了實驗時間。” Hatler說。

伯樂公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白質轉移系統(tǒng)是實驗臺面大小的儀器，能夠提供快速而的轉印。得益于新的轉印緩沖液配方，特殊的過濾材料和增強的電流強度（由一個集成電源調節(jié)），這一系統(tǒng)能夠在短至3分鐘的時間內完成轉印，并且印跡結果能與槽式轉移相媲美。傳統(tǒng)的半干轉移系統(tǒng)需要15到60分鐘時間，而且通常無法提供高分子量蛋白質轉移的有力結果。

增加驗證點以緩解憂慮

蛋白質印跡法的高失敗率常常令人感到非常沮喪，尤其是你需要若干天來換取一個結果。“這是一項非常不穩(wěn)定的技術，”伯樂公司“蛋白質印跡組”市場Ryan Short說，“我們對用戶調查時發(fā)現(xiàn)，一半的用戶報告他們用此技術的失敗率至少是25%。”

Short還說：“幾乎沒有什么機會可以檢查實驗過程是否滿足期望。由此就產(chǎn)生了焦慮。我們正在引入可視驗證點的概念來增加信心和確定性。”

這家公司的標準和Mini-PROTEAN免染色預制膠，利用其ChemiDoc MP膠成像系統(tǒng)，使得研究者可以快速觀測到他們的蛋白是否正確地載入到凝膠上，進而確證高質量的蛋白質轉移，便于決定是否應該轉向下一個步流程或是重新開始。ChemiDoc MP系統(tǒng)是為化學發(fā)光和多元熒光斑點成像技術所設計，能夠在個人電腦上用ImageLab軟件來操作。

這些驗證點“真的很有用”，在實驗室使用該系統(tǒng)的加州大學戴維斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我們可以成像這些免染的凝膠，不用加入額外的染料，而且能夠快速判斷跑在膠上的樣品是否出現(xiàn)問題。我們還能在蛋白質轉膜之后再去對凝膠成像，如果其中任何一個步驟出現(xiàn)問題，我們都可以在這一點上停止實驗進程。”

成像和軟件提高定量性

當許多科學家仍在使用膠片分析蛋白質印跡時，世面上開始出現(xiàn)越來越多的寬范圍免膠片凝膠記錄成像系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以用來成像并分析化學發(fā)光的印跡、熒光的印跡斑點或者同時檢測這兩種印跡。許多公司開始紛紛努力，爭相制造盡可能便捷的成像儀及其分析軟件。很多公司提供了按鍵式成像捕捉系統(tǒng)，其大小可在實驗臺上操作。

Syngene公司于2012年4月推出了非常簡潔的一鍵操作系統(tǒng)PXi，分析化學發(fā)光和熒光印跡。該系統(tǒng)是基于該公司的G:BOX成像系統(tǒng)，并配有GeneSys成像軟件。

2012年10月，賽默飛世爾公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像儀，使用紫外和可見光透射法，專業(yè)的濾鏡和電荷耦合器件（CCD）攝影技術去捕獲和分析蛋白質印跡以及蛋白和核酸凝膠。

CCD照相機的靈敏度比X射線膠片高兩倍，據(jù)該公司介紹，該儀器的動態(tài)范圍高達10倍。用戶只需簡單地按下觸摸屏上其中一個*預設按鈕，無需調焦或調節(jié)照相機的設置。用戶也可以設置定制曝光，并可同時設置多達5個不同的曝光，或者使用預設的曝光參數(shù)。這臺成像儀占用的儀器空間很小，可以在實驗臺上使用。

Aplegen公司的Omega Lum G凝膠記錄系統(tǒng)也具有自動聚焦的特點，可以在實驗臺上操作，并配備了一臺整合的平板電腦。UVP公司在2012年1月推出了Chemi-Doc-It TS2成像儀，其特色在于整合的電腦和觸摸屏，允許用戶調節(jié)曝光、光圈、放大縮小和焦距等參數(shù)，當用戶按下實時預覽（Live Preview）按鈕時，還能提供圖像實例。

LI-COR公司的紅外成像系統(tǒng)版本是Odyssey CLx，該版本具有超過6對數(shù)的動態(tài)范圍，而前一個版本只具有超過4對數(shù)的動態(tài)范圍。當對蛋白質印跡結果進行解析時，這一增大的范圍能消除飽和度，提供了更寬的線性范圍可以轉換為定量數(shù)據(jù)。

“研究者在他們的印跡中不僅不會達到飽和，而且他們還可以將多重印跡結果放進成像儀中，根本無須擔心為這些印跡進行不同的設置調整。”位于林肯市的Nebraska公司產(chǎn)品市場Jeff Harford解釋說。

Rehana Leak是位于匹茲堡的美國迪尤肯大學（Duquesne University）的助理教授，她使用LI-COR的Odyssey CLx系統(tǒng)進行細胞如何適應低水平脅迫的研究。“Odyssey成像儀的優(yōu)勢在于它是16位的成像儀，并且具有700和800納米兩個紅外波長，一次能夠成像兩個斑點。” Leak說，“這意味著我們可以一起檢測磷酸化和全部構象的蛋白。”兩個蛋白亞型通過其他方法很難進行同步區(qū)分，因為它們的基團非常相似。

Leak指出，Odyssey成像儀能夠可視化216個紅外線信號暗影，與之相比，X射線膠片只能灰度的呈現(xiàn)150個暗影。“這將從150個躍遷到65000個紅外暗影，因此這種方法可以獲取更高的分辨率。”她接著說，“這是不同尋常的定量化。”

2012年12月，LI-COR公布了一套新的數(shù)字成像系統(tǒng)，即C-DiGit系統(tǒng)，能夠用于化學發(fā)光印跡。該系統(tǒng)將于2013年推出。“就像zui近這些年數(shù)碼照相機取代膠片相機一樣，我們認為C-DiGit系統(tǒng)必將替代膠片化學發(fā)光。” LI-COR資深科學家Jon Anderson說，“這項技術能提供膠片用戶所習慣的所有靈敏度和圖像質量，同時顯著提升了數(shù)字圖像的質量。”

軟件始終保持直觀

傳統(tǒng)的軟件分析蛋白質印跡時需要用戶從圖像向電子表格導出數(shù)據(jù)，而后續(xù)的均一化計算和分析都由手動完成。BioRad于2012年9月發(fā)布的Image Lab 4.1軟件，針對看家蛋白或總上樣蛋白提供嵌入式、自動化的均一化。

“這是目前我在市面上見到的的產(chǎn)品之一。”Gomes說，他正在研究蛋白酶體和肌鈣蛋白在心臟和骨骼肌組織中的作用。“的一點是，它是*免費的。”Image Lab 4.1軟件比他之前在實驗室用過的圖像分析軟件都要簡便，Gomes接著說，幾乎每個人都能掌握。“這的確增強了我們定量蛋白質的方法。”

LI-COR公司也已經(jīng)推出了新的成像軟件——Image Studio，能與其Odyssey系統(tǒng)一起使用。用戶只需選擇一個檢測通道，然后按一個按鈕就能獲得一張圖像。這個軟件的新版本提供毫米間隔的分析，而不是厘米間隔的，同時又能夠執(zhí)行*的自動和手動分析。

重新打造蛋白質印跡

除了對傳統(tǒng)的蛋白質印跡技術進行微調，ProteinSimple公司的Simple Western系統(tǒng)對其進行了重新開發(fā)，用毛細管電泳使整個過程*自動化。在2011年，該公司推出了Simon，計劃使用該儀器全面取代蛋白質印跡法。Simon能夠基于大小進行分離、免疫檢測、洗滌、化學發(fā)光檢測和定量分析?？茖W家們僅需要加上樣品，然后離開，稍后回來就能得到*分析好的數(shù)據(jù)。Simon甚至能夠發(fā)出蜂鳴聲告知用戶結果出來了。

該公司緊接著在2012年初推出了Sally，該儀器允許用戶在一次實驗中進行96個Simple Western。而的設備則是2012年9月推出的Peggy，能夠一次分析96個樣品，并能按照尺寸或電荷分離蛋白。Simple Western克服了傳統(tǒng)蛋白質印跡法中手動部分的缺陷，比方說缺少重復性或定量化結果。此外，在傳統(tǒng)蛋白質印跡法中，多重檢測已經(jīng)成為一種挑戰(zhàn)。研究者現(xiàn)在可以利用熒光去觀測一個樣品中的2個或3個蛋白質，轉移的設備可以一次同時跑8塊迷你膠或4塊中等大小的膠，但這已經(jīng)是傳統(tǒng)蛋白質印跡法所能達到的極限。Simple Western能夠在每個毛細管中多重分析蛋白質，從而在本質上消除傳統(tǒng)蛋白質印跡法的限制。

對于斯坦福大學醫(yī)學院的腫瘤學教師Alice Fan來說，Simple Western技術zui令人興奮的事情在于它分析顯微級別樣品的能力。

Fan收集樣本組織樣本的時間已經(jīng)超過10年，她一直在等待那個能夠讓她分析腫瘤細胞蛋白質組的工具，而且還無需用去整個樣品。“我找尋了多年，希望有一個設備能夠用極少量的組織進行蛋白質印跡。”她解釋說。

除了幫助她保存之前儲存的組織之外，Sally還讓Fan可以使用細針穿刺法多次從樣本身體中提取一些樣本，而不是做全面的活體檢視。Fan希望，這將能夠幫助她實時觀測樣本的腫瘤對藥物產(chǎn)生的反應。“在描述不同類型的腫瘤方面，這真的對我的研究大有裨益。這是巨大的進步。”

默克公司（Merck & Co）疫苗生物化學團隊負責人Richard Rustandi在2011年底購入了一臺Simon儀器。當時，他并沒有抱有很高的期待。但是，他說，他得到了意外的驚喜。“這臺儀器太棒了，我們在幾個月后又買了一臺。”

據(jù)Rustandi介紹，盡管Simon并不是無瑕的，但它能夠真正實現(xiàn)定量化。他接著說，手動的蛋白質印跡法通常具有35%到45%的變異率，但他和他的實驗室能夠將Simon的變異率控制在10%以下。

隨著蛋白質印跡技術地不斷演化，研究者zui終不用像保姆一樣，花費大量的時間照看著他們的實驗。“他們的時間非常重要。” Simple Western的產(chǎn)品Peter Fung認為，“你的時間利用率越高，就越能做出好的研究。”